UNIDAD X: TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

SEP                          SNEST                   DGEST

UNIDAD X: 

TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

QUE PRESENTA:

Arisbeth Salgado Mendoza

09930054

Lic. BIOLOGIA VI "A"

Ciudad Altamirano, Gro. México. JUNIO del 2012

INTRODUCCIÓN:

Se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas difrenctes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hpatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diganóstico de identidad forense, etc.

La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para elminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

OBJETIVOS: 

• Conocerá y aplicará las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.

METODOLOGÍA:

En esta unidad vamos a verificar los pasos correspondientes en la unidad así analizarla y el profesor darnos a conocer como se lleva acabo las técnicas de la biología molecular así como los métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos y sobre todo la técnica de HIBRIDACION.

10.1 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

La concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.

En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:

1.      separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida. En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas.

2.      detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados.

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcada.

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 

10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACION

Las técnicas de hibridación se parte de dos poblaciones de ácidos nucléicos: un conjunto homogéneo de ácidos nucléicos de secuencia conocida que actúa como sonda y otro conjunto heterogéneo de ácidos nucléicos de secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estar marcada. Si lo está la sonda, la hibridación es estándar. Si lo está la diana, la hibridación es reversa. Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, bien procedentes de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restricción, bien oligonucleótidos sintéticos. La hibridación puede producirse en medio líquido o sobre un soporte sólido, como nitrocelulosa, al que se encuentra unida una de las dos poblaciones de ácidos nucléicos. En la hibridación estándar sería el ADN diana el que iría unido al soporte sólido, mientras que en la hibridación reversa sería la sonda. Durante la hibridación se produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de la complementariedad de bases. Se pueden adaptar las condiciones para conseguir la especificidad de secuencia requerida para que se produzca la hibridación. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración de cloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existan algunas bases no complementarias. Por el contrario un aumento de la temperatura o una disminución de la fuerza iónica producen una hibridación más específica que tolera menos fallos en la complementariedad de las secuencias a hibridar. Estas condiciones varían según el objetivo de la prueba: Así, por ejemplo, comparar ADN de especies diferentes necesita condiciones relajadas, pero identificar mutaciones puntuales en un gen necesita condiciones que fuercen una hibridación muy específica. 

La hibridación es la base de muchas técnicas moléculares, como en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), Northern Blot, Southern Blot, microarrays de ADN, hibridación in situ o screening de genotecas. Su uso extendido en diagnóstico molecular abarca el diagnóstico de enfermedades, la identificación de microorganismos patógenos, el análisis de perfiles de expresión génica, la localización de genes en cromosomas, la detección de ARNm en tejidos in situ o la comparación de especies de patógenos.

10.3 TÉCNICAS DE CLONACION DE GENES

FASES

1. Preparación del gen

2. Inserción en el vector

3. Transformación de la célula hospedadora

4. Detección de genes clonados

5. Optimización de la expresión de los genes clonados

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.

10.4 PRUEBA DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction) es una técnica de amplificación de secuencias de DNA in vitro.

Pasos en la PCR

KLENOW

• Desnaturalización 100oC

• Unión cebadores y polimerización 37oC Taq POLIMERASA

• Desnaturalización 95oC

• Unión cebadores (45-55oC) Tm

• Polimerización 72oC

Elementos de la PCR

• DNA Molde

• Cebadores (oligonucleótidos)

• DNA polimerasa termoestable

• Desoxinucleótidos trifosfatos

• Tampón de reacción

• pH

• Cationes divalentes

• Cationes monovalentes

Aplicaciones

• Clonaje de genes

• Diagnóstico

• Evolución molecular

• Cuantificación de mRNAs

• Secuenciación

• Localización de AN in situ

• Forense

• Otras

Uno de los argumentos mayores contra la hipótesis VIH=SIDA es que cuando se utilizan métodos tradicionales de detección de virus, el VIH nunca ha sido hallado en cantidades significativas en personas con SIDA. Puesto que se precisan millones o miles de millones de copias de un virus para enfermar, un problema para la hipótesis VIH=SIDA era que, incluso usando la PCR estándar (normal), los investigadores no podían encontrar en las personas con SIDA mucha cantidad de VIH, si es que encontraban alguna. Para resolver esta paradoja, los autores de los artículos de la nueva «carga viral» salieron con dos nuevas modificaciones de la PCR, de las cuales afirmaban que eran mucho más eficaces para encontrar el VIH. Estas fueron la PCR-QC y la PCR de ADN ramificado (b-DNA PCR). Y de repente, -¡eureka!- hallaron miles de millones de copias del VIH.

10.7 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. A esto justamente se dedica labiotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación:

1) el conocimiento de las enzimas de restricción.

 2) la replicación y reparación de ADN.

 3) la replicación de virus y plásmidos.

 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos. 

Las enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de DNA.

Las enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al genero (E) y las otras dos a la especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la designación de una cepa ( R) y un número romano (I) para indicar el orden del descubrimiento.

El tipo más común de enzimas de restricción (tipo II) usado en la tecnología del DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energía para el clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unión específica al DNA y posterior clivaje.

Otras enzimas de restricción clivan palíndromos de DNA de 4 o 6 pb. Algunas otras enzimas de restricción clivan una secuencia única. Estas enzimas que reconocen la misma secuencia se llaman ISOCHIZOMERS.

Las enzimas de restricción de tipo OO son parte de un sistema de restricción / modificación en la bacteria. La misma tiene un “sistema” de protección contra sus propias enzimas de restricción a través de una enzima acompañante que metila nucleótidos de su ADN y los convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido en las secuencias de 6 reconocimientos. Por esto es que las ADN metilasas de sitio específico y las enzimas de restricción siempre están por pares en una bacteria.

CONCLUSIÓN:

En esta unidad vimos como se llave a cabo las técnicas de la biología molecular, así como los métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos, la técnica de HIBRIDACION, etc... en esos pasos el profesor nos explico detenidamente para así poder nosotros interpretar muy bien..

BIBLIOGRAFIA:

• http://free-news.org/cjohns02.htm
• http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologia-del-adn recombinante/que_es_la_tecnologia_del_adn_r.php
• http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/dnarec07.pdf